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Comment#11 On the discrimination of soil samples by derivative diffuse reflectance UV–vis-NIR spectroscopy and chemometric methods

2021/07/26
作夢也想不到會寫超過10篇網誌，今天的內容是鑑識科學，也不能只停留在土壤及農業，多角化才能開創藍海對吧。雖然這次的內容不是我使用的可攜式儀器，但一樣的光譜範圍，原理是差不多的。

Topic:
Chauhan, R., Kumar, R., Kumar, V., Sharma, K., and Sharma, V. 2021. On the discrimination of soil samples by derivative diffuse reflectance UV–vis-NIR spectroscopy and chemometric methods. Forensic Science International, 319, 110655.
https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2020.110655

Introduction

在鑑識科學 (forensic science) 領域中，土壤是一種重要的微量物證 (trace evidence)。由於其可轉移的性質 (transferable property)，土壤可以附著在嫌疑犯的衣著、鞋子或是車輛。以往的土壤分析包含化學性質、物理性質分析的速度較慢，因此光譜法的快速便成為一大優點，本文所使用的UV-vis-NIR光譜法更是其中的佼佼者。UV-vis-NIR光譜法可辨識並定量土壤中的有機/非有機物質，與土壤學不同的是，鑑識科學中通常能夠取得的土壤樣品量是非常少的 (誰像你土壤學用鏟子挖)，且光譜法尚未被廣泛應用。
但是，由於光譜的複雜性，必須利用統計方法才有辦法分辨不同來源土壤的差異性，因此本文會使用一些統計方法。而為了減少樣品前處理，因此並不使用桌上型UV-vis-NIR光譜儀常用的穿透式 (transmission mode)，而是使用擴散反射式 (diffuse reflectance mode)，就如同在土壤近地感測上所使用的。
另外樣品還會經過加熱處理，是因為要模擬縱火 (arson) 事故中的殘留土壤。這段前言讀完只覺得應用性無窮。

Materials and methods

土壤收集
在印度西北部收集五個州的土壤，包含Rajasthan (Y1)、Haryana (Y2)、Chandigarh Tricity (Y3)、Punjab (Y4) 及Delhi NCR (Y5)，每個州內又有為數不一的採樣城市，總共18個地點。在劃定一個長寬皆為10 m的區域後，土壤中的人造物質會先被移除，從表土及15 cm深處收集各500 g土壤，每個地點收集五重複 (四個角與中央)，表土編號S1-S18 (surface)，15 cm深處的土編號D1-D18 (depth)。樣品室溫風乾後通過10 mesh的篩網 (2 mm)，但保留一部分不過篩以觀察過篩的影響，表土樣本另外以650°C烘乾觀察。

光譜方法
使用Shimadzu 2600 Series UV-vis-NIR光譜儀搭配ISR-2600 plus Integrating Sphere (一個搭配零件，以圓形的鏡面聚集光線)，僅使用0.5-1 mg的土樣進行量測。空白校正使用硫酸鋇 (barium sulfate, BaSO4) 粉末作為100%反射的參考，共量測200-1400 nm波長範圍的反射率，但700-1400 nm波長的特徵較少故此段波長不進行後續統計分析。
擴散反射的反射率光譜先轉換成吸光度，這部分利用Kubelka-Munk (K-M) transformation，並取得一階微分的光譜。重複性有經過五重複的測試結果為重複性良好。

統計分析
Discriminating power (DP)：
作者以人工方式比較不同波峰在每種土壤出現的差異性，來自不同兩地的土壤就是一組可能的區別，而觀察兩者的波峰位置，若波峰位置一致，則代表並無法被區別出來，這就是Discriminating power，衡量樣品能夠被光譜資料區別的能力，DP的計算方法為
\(DP = \frac{Number \, of \, Discrimated \, Sample}{Number \, of \, Possible \, Sample \, Pair} \times 100\)

Cluster analysis：
目的是要分群 (clustering) 的話，兩種常見的方法包含hierarchical clustering analysis (HCA) 及k-means，但在使用這分群方法之前先以standard normal variate (SNV) 方法進行標準化。在260-600 nm範圍內的光譜經SNV後以1 nm的解析度進行HCA。

Linear discriminant function analysis (LDA)：
由於表土是最容易被帶走而成為物證的，故僅對表土進行分類 (classification)，而分類的方法為LDA，可以將組內差異最小化並且使組間差異最大化，並且以leave-one-out cross-validation作為交叉驗證方法。
衡量標準包括canoical correlation、eigenvalue及Wilks’ Lambda。

Results and discussions

光譜特徵
呈現的是光譜的一次微分，且經過SNV與Savitzky-Golay平滑化來去除雜訊，作者辨識到的特徵中較為重要的有

其他還有可以參考作者原文。整體而言200-260 nm代表芳香環、不飽和的有機化合物與可溶性有機碳；261-280 nm代表芳香環與腐植化 (humification) 程度；281-300 nm與π-π*的電子有關 (因此也跟芳香環有關)；301-500 nm則與glutamic acid, fulvic acid, Pb及鐵氧化礦物有關；501-600 nm與黏土礦物、針鐵礦 (hematite) 及Zn有關；最後601-700 nm則跟鐵氧化物有關。

Discrimination
在人工比對出現波峰後，有些組別的光譜特徵相當一致，這些波峰特徵相近的組別在人為比對中沒有被區別出來，也多為鄰近地區的土樣，相對的，可以被區分的組別是DP計算中的分子，而分母為所有可能的組別，即N(N-1)/2。
表土DP = 96.08%，15 cm深度的土DP = 97.39%，因此分別程度是很好的。
接著需要嘗試以多變量統計方法分別，使用的方法是HCA，表土樣品被區分成9組，15 cm深度的土則被區分成15組，相對於原本是從18個地點採的，算是可接受的結果，作者進一步使用相關性的陡坡圖 (scree plot) 來衡量，表土與15 cm深度土的elbow分別位於第9與第3個分支，因此前面分組的結果是合理的。以HCA所區分的表土DP = 98.26%，15 cm深度的土DP = 99.78%，也都非常好。
作者接著使用Kaiser Meyer Olkin (KMO) test與Bartelett test驗證此組樣品適合進行主成分分析 (principal component analyaia, PCA)。
表土PCA結果中，前三個主成分解釋了97.48%的變異 (PC1 = 52.61%，PC2 = 28.06%，PC3 = 16.81%)，這三個是根據Kaiser Criteria選取出來eigenvalue符合的主成分。作者將每個主成分各自的變異計算出來，並將兩個樣本之間的差距小於主成分的變異則稱作無法區別，這樣的處理發現所有的樣品都可在主成分分析中被區分出來，DP = 100%。
再查看變數的負荷 (loading) 發現，各主成分中明顯負荷較高的波長也有區別，這可以將不同的主成分對應至土壤的化學組成，例如作者有發現PC3有較其他主成分較高的375 nm (glutamic acid) 負荷。而15 cm深處土壤的PCA結果也類似，均能被區分出來。
作者以PCA測試六個未知土樣，其中有五個被完美疊合至已有的樣品點上，可以判定這些土樣的來源，但有一個點並未跟任何點疊合。

Classification
使用LDA來進行分類，在PDA中區分regression factor score value及rotated component value，前十個主成分的regression factor score (即在PCA軸上的分別) 被拿來輸入LDA。之後使用變方分析 (one-way analysis of variance, ANOVA) 來測驗這十個變數的獨立性，以Wilks’ Lambda篩選後只有PC2, PC3, PC4及PC7被選入LDA的判別方程式中 (有興趣的可以進一步看這篇的LDA方法)。
接著建立LDA的discriminant function equation (DF)，預先設定的條件為eigenvalue > 1且canonical correlation > 0.35，建立了四條DF方程式並且繪圖表示。
在LDA的結果中，達到100%的判定率，所有的土壤都被分類到原先指定的類別 (即那五個州) 中，leave-one-out cross-validation的結果也有95%正確。雖然模型非常準確預測，但仍有一些缺陷，例如在光譜中會有一些較複雜的波峰 (convoluted peak，經過不同波峰合併起來很難區分的)。

Effect of heating and sieving
以PCA分析並繪製未過篩與經過加熱的土壤，並與實驗土壤比較，發現這兩者都與實驗土壤有很明顯的區別，在未過篩土壤中含有許多外來物質，而加熱則摧毀許多土壤中的物質例如容易揮發的有機物，因此在經過加熱的土壤，其光譜特徵是會大幅改變的。

單字

procure: (v.) 取得
prerequisite: (n.) 先決條件